Vidljivo i brzo otkrivanje mačjeg chaphamaparvovirusa korištenjem multienzimskog izotermalnog brzog pojačanja i testa mjerne trake s bočnim protokom
Časopis:Granice u staničnoj i infekcijskoj mikrobiologiji
Faktor utjecaja:4.6
Chaphamaparvovirus mačaka(FeChPV)je novi parvovirus, prvi put otkriven u mačkama s proljevom u Kanadi 2019. Njegova patogenost i molekularne karakteristike ostaju nejasne, a pokazuje različitost domaćina i genetsku raznolikost, što zahtijeva daljnje epidemiološko istraživanje. Trenutno ne postoji standardizirana metoda za detekciju FeChPV.
Metoda multienzimske izotermne brze amplifikacije-lateralnog protoka (MIRA-LFD)uspješno se koristi za otkrivanje raznih virusa, nudeći prednosti kao što su brzina, jednostavnost i nema potrebe za preciznim instrumentima. Istraživački tim uspostavio je MIRA-LFD metodu prikladnu za FeChPV za rješavanje izazova u lokalnom kliničkom otkrivanju. Bez oslanjanja na precizne instrumente,metoda MIRA-LFD dovršila je otkrivanje FeChPV-a na 37 stupnjeva unutar 20 minuta i nije pokazala unakrsnu-reaktivnost s drugim virusima. Granica detekcije bila je 32,3 kopije/μL,10 puta veći od PCR metode. Nadalje, metoda MIRA-LFD otkrila je 29 FeChPV-pozitivnih uzoraka među 417 mačaka s proljevom, sa stopom pozitivnosti nešto višom od one kod metode nested PCR. Ovi rezultati pokazuju da je uspostavljena MIRA-LFD metoda za otkrivanje FeChPV-a učinkovita, ekonomična, pouzdana i jednostavna metoda koja pridonosi ranoj prevenciji i kontroli infekcije FeChPV-om.
1. Eksperimentalne metode
Klinički uzorci:Uzorci rektalnih briseva korišteni u ovoj studiji prikupljeni su od 632 mačke (uključujući 417 s proljevom i 115 zdravih mačaka) i 474 psa (uključujući 342 s proljevom i 132 zdrava psa) u veterinarskim klinikama u provincijama Guangdong, Henan, Anhui, Zhejiang i autonomnoj regiji Unutarnja Mongolija između 2022. i 2024. godine.
Amplifikacija nukleinske kiseline:Ekstrahirana DNA nukleinska kiselina dodana je u MIRA sustav. Rekombinaza i početnice tvorile su kompleks; uz pomoć pomoćnih proteina i jedno-vezujućih proteina, napali su dvostruko-lančani predložak DNA. Primeri su se vezali na homologne komplementarne regije kako bi formirali regiju petlje D-, dok se rekombinaza rastavljala od kompleksa. Polimeraza se vezala za 3' kraj početnica i pokrenula sintezu DNA, eksponencijalno pojačavajući ciljnu regiju na matrici. Ovaj se proces odvijao brzo i učinkovito, čime se postiglo ultra-amplificiranje ciljanog fragmenta u samo 15 minuta.
Razvoj boje test trake:Produkt amplifikacije nukleinske kiseline razrijeđen je 1:10, nanesen na test traku, a rezultati su očitani nakon 5 minuta.
Cijeli proces od amplifikacije nukleinske kiseline do razvijanja boje test trake trajao je samo 20 minuta.
U eksperimentu su korišteni -budući biološki proizvodi:
U studiji su ispitana četiri dizajnirana skupa specifičnih kombinacija-sondi. I elektroforeza u agaroznom gelu i test trake nukleinske kiseline korištene su za prikaz rezultata. Sve četiri kombinacije-probnih sondi mogle su otkriti FeChPV virus. Prema rezultatima elektroforeze u agaroznom gelu, kombinacija FeChPV-4 pokazala je najsvjetliju ciljnu traku, pa je ova kombinacija odabrana za naknadno testiranje.
Prema rezultatima elektroforeze na agaroznom gelu, amplifikacija od 5, 10, 15 i 20 minuta dala je ciljnu vrpcu. Intenzitet ciljane trake dosegao je vrhunac nakon 15 minuta pojačanja, čime je 15 minuta postalo optimalno vrijeme reakcije za ovaj test. Amplifikacija na 36 stupnjeva, 37 stupnjeva, 38 stupnjeva, 39 stupnjeva i 40 stupnjeva proizvela je ciljnu traku, s najsvjetlijom trakom uočenom na 39 stupnjeva, uspostavljajući 39 stupnjeva kao optimalnu reakcijsku temperaturu za ovaj test.
(Slika A: 1: Pojačanje 5 minuta; 2: Pojačanje 10 minuta; 3: Pojačanje 15 minuta; 4: Pojačanje 20 minuta) (Slika B: 1: Pojačanje 36 stupnjeva; 2: Pojačanje 37 stupnjeva; 3: Pojačanje 38 stupnjeva; 4: Pojačanje 39 stupnjeva; 5: Pojačanje 40 stupnjeva)
2. Izvedba detekcije
Osjetljivost:
(Slika A: MIRA rezultati prikazani elektroforezom u agaroznom gelu)
(Slika B: Rezultati ugniježđene PCR prikazani elektroforezom u agaroznom gelu)
(Slika C: MIRA rezultati prikazani pomoću test traka za nukleinsku kiselinu)
Uzorci su podvrgnuti 10-strukim serijskim razrjeđenjima počevši od 3,23×10⁶ kopija/μL. Nested PCR s elektroforezom u agaroznom gelu može stabilno otkriti 3,23×10² kopija/μL; MIRA s elektroforezom u agaroznom gelu i MIRA s test trakama za nukleinsku kiselinu mogle su stabilno otkriti 3,23×10¹ kopija/μL.
Metoda MIRA pokazala je dosljednu osjetljivost korištenjem dva različita formata prikaza rezultata, a osjetljivost metode MIRA bila je bolja od one ugniježđene PCR.
Specifičnost:
(1: FeChPV, mačji chaphamaparvovirus; 2: FPV, mačji virus panleukopenije; 3: FeAstV, mačji astrovirus; 4: FBoV, mačji bocavirus; 5: CachaV, pseći chaparvovirus; 6: negativna kontrola)
Novouspostavljena MIRA-LFD metoda otkrila je samo FeChPV i nije pokazala unakrsnu-reaktivnost s drugim referentnim virusima, što ukazuje na dobru specifičnost.
3. Sažetak studije
Ovo je istraživanje uspostavilo MIRA-LFD metodu za otkrivanje FeChPV-a bez potrebe za visoko{1}}preciznim instrumentima. Kao učinkovita, ekonomična i pouzdana metoda detekcije s visokom osjetljivošću i specifičnošću, MIRA-LFD metoda je prikladnija za kliničku detekciju, pružajući tehničku podršku za ranu prevenciju i kontrolu FeChPV infekcije.
4.AMP-BIOTEHNIKA BUDUĆNOSTI
MIRA multienzimska izotermna brza amplifikacija nukleinske kiseline tehnologija je koja uistinu omogućuje brzo otkrivanje-na licu mjesta.
MIRA tehnologija temelji se na in vivo mehanizmu popravka rekombinacije gena, oslanjajući se na sinergijsko djelovanje višestrukih funkcionalnih proteina na sobnoj temperaturi kako bi se postigla brza (5-20 min), osjetljiva, specifična i sigurna amplifikacija nukleinske kiseline na sobnoj temperaturi (25 stupnjeva –45 stupnjeva). Zbog izotermne prirode MIRA tehnologije, ona ima niske zahtjeve za opremom i jednostavan rad. Putem minijaturiziranih prijenosnih uređaja, može se primijeniti u prvom testiranju u različitim scenarijima primjene, donoseći brzo i precizno testiranje nukleinske kiseline u postavke kao što su POCT, kućno testiranje, poljoprivredna polja i-policija na licu mjesta. Na temelju tehnologije MIRA, Amp-future Biotech je razvio niz proizvoda za brzo testiranje na-na licu mjesta, uključujući agense za brzo otpuštanje nukleinske kiseline, izotermalne reagense za brzo pojačanje nukleinske kiseline, test trake s koloidnim zlatom i minijaturiziranu prijenosnu opremu, stvarajući cjelokupno rješenje za-brzo molekularno testiranje na licu mjesta. Nadalje, MIRA tehnologija tvrtke Amp-future nudi prednosti primjene u kombinaciji s CRISPR tehnologijom, NGS, SNP, mikrofluidikom itd.
Uz gore-nizu proizvoda za brzo testiranje na licu mjesta, Amp-future Biotech također nudi:
Reagensi za istraživanje:Osiguravanje sirovina za reagense i tehničke podrške za temeljna znanstvena istraživanja, kao i literatura za projekte.
OEM proizvodnja:Sposoban samostalno proizvoditi gotove proizvode visoke-čistoće, visoke-aktivnosti tijekom cijelog procesa, postižući industrijsku-proizvodnju.
Naručeni razvoj projekta:Podaci o sekvenci i rezultati analize poravnanja sekvenci, dizajn i sinteza sonde primera-projekta, sinteza i uzorci plazmida projekta, izvješća i rezultati projekta itd.
Za više informacija, dobrodošli na upit.