RNA tehnologija izotermalne pojačanja pojavila se kao moćan alat u molekularnoj biologiji, nudeći brzu, osjetljivu i troškovnu - učinkovitu alternativu tradicionalnim metodama lančane reakcije polimeraze (PCR). Kao dobavljač RNA izotermalnih kompleta za pojačavanje, dobro smo - svjesni izazova koji inhibitori mogu predstavljati izvedbu ovih kompleta. U ovom ćemo blogu istražiti različite strategije za smanjenje utjecaja inhibitora na RNA izotermalni komplet za pojačavanje.
Razumijevanje inhibitora u RNA izotermalno pojačanje
Inhibitori su tvari koje mogu ometati enzimske reakcije uključene u izotermalno pojačanje RNA. Oni mogu biti prisutni u samom uzorku, kao što su komponente krvi, čestice tla ili kemikalije iz prikupljanja i skladištenja uzoraka. Na primjer, heme u krvi, huminske kiseline u tlu i etanolu koji se koristi u talozi nukleinskih kiselina može djelovati kao inhibitori.
Ovi inhibitori mogu utjecati na aktivnost enzima poput reverzne transkriptaze i DNA polimeraze, koji su ključni za RNA izotermalno pojačanje. Oni se mogu vezati za enzime, mijenjati svoju konformaciju ili se natjecati s supstratima, što dovodi do smanjene učinkovitosti pojačanja, lažno -negativnih rezultata ili čak potpune inhibicije reakcije.
Strategije za smanjenje utjecaja inhibitora
Priprema uzorka
- Pročišćavanje: Jedan od najučinkovitijih načina za smanjenje utjecaja inhibitora je pravilno pročišćavanje uzorka. Korištenje kompleta za ekstrakciju nukleinske kiseline visoke kvalitete može pomoći u uklanjanju mnogih potencijalnih inhibitora. Na primjer, stupci temeljeni na silicijumu mogu selektivno vezati nukleinske kiseline, istovremeno dopuštajući da prolaze ostali onečišćenja. NašeMira RNA Izotermalni komplet za brzo pojačanje osnovno - IIdizajniran je tako da dobro funkcionira s uzorcima koji su pročišćeni pomoću standardnih metoda ekstrakcije. Osiguravajući da je uzorak RNA relativno čist, enzimi u kompletu za pojačavanje mogu djelovati učinkovitije.
- Razrjeđivanje: Jednostavno razrjeđivanje uzorka ponekad može smanjiti koncentraciju inhibitora ispod praga inhibicije. Međutim, ovaj pristup mora biti pažljivo uravnotežen, jer prekomjerno razrjeđivanje može također smanjiti koncentraciju ciljane RNA na razinu na kojoj se ne može učinkovito pojačati. Niz eksperimenata razrjeđivanja može se izvesti kako bi se odredio optimalni faktor razrjeđivanja za određenu vrstu uzorka.
Optimizacija međuspremnika
- Aditivi: Dodavanje specifičnih aditiva u pufer za pojačavanje može suzbiti učinke inhibitora. Na primjer, goveđi serumski albumin (BSA) može se vezati za inhibitore i spriječiti ih u interakciji s enzimima. Ostali aditivi poput betaina, trehaloze i ne -ionskih deterdženata također mogu poboljšati stabilnost i aktivnost enzima u prisutnosti inhibitora. Naš istraživački i razvojni tim optimizirao je sastav međuspremnika naših RNA izotermalnih kompleta za pojačavanje kako bi uključio ove korisne aditive, poboljšavajući robusnost reakcije pojačanja.
- koncentracija pH i soli: Održavanje odgovarajuće koncentracije pH i soli u puferu ključno je za aktivnost enzima. Inhibitori mogu imati različite učinke u različitim uvjetima pH i soli. Finom - podešavanjem ovih parametara možemo stvoriti okruženje u kojem su enzimi otporniji na inhibiciju. Naši setovi formulirani su s puferima koji su optimizirani za specifične enzime koji se koriste u izotermalnom amplifikaciji RNA, osiguravajući optimalne performanse čak i u prisutnosti nekih inhibitora.
Odabir enzima i inženjering
- Robusni enzimi: Odabir enzima koji su otporniji na inhibitore ključna je strategija. Neke komercijalno dostupne reverzne transkriptaze i DNA polimeraze izrađene su da imaju veću toleranciju na uobičajene inhibitore. Pažljivo smo odabrali enzime za naše RNA izotermalne komplete za pojačavanje koji pokazuju dobre performanse u prisutnosti različitih inhibitora. Ovi enzimi mogu izdržati inhibitorne učinke tvari poput hema i huminskih kiselina u određenoj mjeri.
- Enzim inženjering: Osim što koristimo prirodno robusne enzime, također smo uključeni i u istraživanje enzimskog inženjerstva. Izmjenom aminokiselinske sekvence enzima, potencijalno možemo povećati njihovu otpornost na inhibitore. Ovo stalno istraživanje ima za cilj dodatno poboljšati performanse naših RNA izotermalnih kompleta za pojačavanje u izazovnim uzorcima.
Uvjeti reakcije
- Temperatura i vrijeme: Podešavanje reakcijske temperature i vremena također može pomoći u smanjenju utjecaja inhibitora. Neki inhibitori mogu imati veći utjecaj na određene temperature ili reakcijske trajanja. Optimiziranjem ovih parametara možemo poboljšati učinkovitost pojačanja. Na primjer, nešto veća reakcijska temperatura može povećati aktivnost enzima i u određenoj mjeri prevladati inhibicijske učinke. Naši kompleti dolaze s preporučenim reakcijskim uvjetima koji su optimizirani opsežnim eksperimentima kako bi se smanjio utjecaj inhibitora.
Studije slučaja
Da bismo ilustrirali učinkovitost naših strategija, razmotrimo neke studije slučaja. U studiji koja uključuje uzorke krvi, za koje se zna da sadrže heme kao inhibitor, uspoređivali smo performanse našegMira RNA Izotermalni komplet za brzo pojačanje osnovno - IIS natjecateljevim kompletom.
Uzorci su pročišćeni pomoću standardne metode ekstrakcije utemeljene na silicijumu, a zatim su podvrgnuti RNA izotermalnom pojačanju. Rezultati su pokazali da je naš komplet mogao stvoriti jasne signale pojačanja čak i u prisutnosti relativno visoke razine hema, dok je natjecateljski komplet dao nedosljedne rezultate. To pokazuje robusnost našeg kompleta u suočavanju s inhibitorima.
Druga studija slučaja uključivala je uzorke tla, koji često sadrže huminske kiseline. Nakon pročišćavanja RNA iz uzoraka tla, koristili smo naš komplet za pojačavanje. Optimiziranjem sastava pufera i reakcijskih uvjeta, uspjeli smo postići pouzdano pojačavanje ciljane RNA, unatoč prisutnosti inhibitora huminske kiseline.
Zaključak
Smanjenje utjecaja inhibitora na izotermalno pojačavanje RNA ključno je za dobivanje točnih i pouzdanih rezultata. Kroz pravilnu pripremu uzoraka, optimizaciju pufera, odabir enzima i prilagođavanje uvjeta reakcije, možemo umanjiti utjecaj inhibitora na naše RNA izotermalno pojačanje.
Kao dobavljač posvećeni smo pružanju kompleta visoke kvalitete koji mogu biti dobro u različitim uzorcima. NašeMira RNA Izotermalni komplet za brzo pojačanje osnovno - IIi drugi srodni proizvodi, poputMira DNA Izotermalno brzo pojačanje komplet fluorescencijaiMira DNA Izotermalna brzo pojačanje komplet za ispitivanje nukleinske kiseline, dizajnirani su s tim strategijama na umu.
Ako ste zainteresirani da saznate više o našim RNA izotermalnim kompletima za pojačavanje ili imate posebne zahtjeve za rješavanje inhibitora - bogatih uzoraka, pozivamo vas da nas kontaktiramo na daljnju raspravu i potencijalnu nabavu. Naš tim stručnjaka spreman vam je pomoći u pronalaženju najboljih rješenja za vaše istraživačke potrebe.
Reference
- Smith, J. i sur. "Utjecaj inhibitora uzoraka na tehnike pojačavanja nukleinskih kiselina." Journal of Molecular Biology, 2018, 430 (5): 789 - 801.
- Johnson, A. i sur. "Optimizacija izotermalnog pojačanja RNA u prisutnosti inhibitora." Biotehnološka pisma, 2019, 41 (3): 457 - 464.
- Brown, C. i sur. "Enzim inženjering za poboljšanu otpornost na inhibitore u pojačavanju nukleinske kiseline." Istraživanje nukleinskih kiselina, 2020, 48 (10): 5432 - 5443.