DNA polimeraza je ključni enzim u molekularnoj biologiji, koji igra središnju ulogu u procesima replikacije i popravljanja DNK. U laboratoriju je pročišćavanje DNA polimeraze pažljiv i višestruki korak koji zahtijeva pažljivo planiranje i izvršavanje. Kao dobavljač DNA polimeraze, dobro sam - upućen u sitnice ovog postupka pročišćavanja i želio bih podijeliti detalje s vama.
Početni koraci: rast stanica i liza
Prvi korak u pročišćavanju DNA polimeraze često započinje s rastućim stanicama koje izražavaju enzim. Obično se bakterije poput Escherichia coli koriste kao stanice domaćina jer su lako kulturu, brzo rastu i mogu se genetski projektirati kako bi prekomjerno eksprimirali ciljnu DNA polimerazu. Bakterije se obično uzgajaju u prikladnom mediju za kulturu u kontroliranim uvjetima temperature, pH i prozračivanja. Na primjer, E. coli se često uzgaja na 37 ° C u bogatom mediju poput lurije - Bertani (LB).
Jednom kada stanice dosegnu odgovarajuću gustoću, oni se skupljaju centrifugiranjem. Stanična peleta se zatim resuspendira u puferskoj otopini. Za oslobađanje DNA polimeraze iz stanica, provodi se korak lize. Postoji nekoliko metoda za staničnu lizu, uključujući mehaničke metode (kao što su sonicijacija), kemijske metode (koristeći deterdženti poput Triton X - 100) i enzimske metode (koristeći lizocim za razgradnju stanične stijenke bakterija). Unificiranje je popularan izbor jer može učinkovito poremetiti stanice bez nanošenja značajnih oštećenja enzima. Međutim, mora se pažljivo kontrolirati kako bi se izbjeglo prekomjerno zagrijavanje uzorka, što bi moglo denalirati DNK polimerazu.
Priprema i pojašnjenje sirovog ekstrakta
Nakon stanične lize, rezultirajuća smjesa sadrži različite stanične komponente, uključujući proteine, nukleinske kiseline, lipide i stanične krhotine. To je poznato kao sirovi ekstrakt. Za uklanjanje velikih krhotina skale, ekstrakt sirove je centrifugiran velikom brzinom. Pažljivo se prikuplja supernatant, koji sadrži topljivi proteini, uključujući DNA polimerazu.
Ponekad, sirovi ekstrakt još uvijek može sadržavati značajnu količinu nukleinskih kiselina koje mogu ometati sljedeće korake pročišćavanja. Da bi se uklonile ove nukleinske kiseline, korak oborina može se provesti pomoću polikacijskog spoja poput polietilenimina (PEI). PEI se veže na negativno nabijene nukleinske kiseline, uzrokujući im taloženje, što se zatim može ukloniti centrifugiranjem.
Kromatografsko pročišćavanje
Kromatografija je kamen temeljac pročišćavanja DNA polimeraze. Postoji nekoliko vrsta kromatografskih tehnika koje se mogu koristiti, a svaka se temelji na različitim načelima razdvajanja.
Ion - razmjena kromatografija
Ion - razmjena kromatografija često je prvi kromatografski korak u procesu pročišćavanja. Razdvaja proteine na temelju njihovog neto naboja. DNA polimeraze imaju karakterističan naboj na određenom pH, što im omogućuje da se vežu ili na pozitivno nabijenu (anion - razmjenu) ili negativno nabijenu (kation - razmjenu) smolu. Na primjer, ako DNA polimeraza ima neto negativni naboj na određenom pH, može se koristiti anionska smola, poput dietilaminoetil (DEAE) celuloze. Narodni ekstrakt se učitava na stupac, a DNA polimeraza veže se na smolu dok prolaze drugi proteini s različitim nabojima. Povežena DNA polimeraza može se eluirati povećanjem koncentracije soli u puferu. Ova je metoda učinkovita u uklanjanju mnogih onečišćenja i može značajno obogatiti DNK polimerazu u uzorku.
Afinitetna kromatografija
Afinitetna kromatografija je vrlo specifična metoda pročišćavanja. To koristi specifičnu interakciju između DNA polimeraze i liganda imobilizirane na smoli. Jedan od uobičajenih pristupa je korištenje HIS -tag sustava. Ako je DNA polimeraza genetski inženjerirana da sadrži histidin oznaku (njegova - oznaka), može se koristiti nikl -nitrilotriacetska kiselina (NI - NTA) smola. Oznaka HIS -a veže se posebno na ione nikla na smoli, omogućujući selektivno zadržavanje DNK polimeraze. Ostali proteini koji nemaju HIS - Tag će proći kroz stupac. Vezana DNA polimeraza može se eluirati dodavanjem imidazola u međuspremnik, koji se natječe s njegovom - oznakom za vezanje na ionima nikla.
Druga vrsta afinitetne kromatografije koja se može koristiti je kromatografija DNA - afiniteta. Budući da DNA polimeraza ima prirodni afinitet prema DNK, može se koristiti DNK - koja sadrži smolu. DNA polimeraza veže se na DNK na smoli, a uklanjaju se i drugi proteini koji ne vežu DNA. Povežena DNA polimeraza može se eluirati promjenom uvjeta pufera, poput povećanja koncentracije soli ili dodavanja DNK konkurencije.
Veličina - Kromatografija isključenja
Veličina - Kromatografija isključenja, poznata i kao gel -filtracijska kromatografija, razdvaja proteine na temelju njihove veličine. Stupac je ispunjen poroznim perlama. Manji proteini mogu ući u pore kuglica i imati duži put kroz stupac, dok veći proteini prolaze kroz prostore između zrnca i ranije eluta. Ova je metoda korisna za uklanjanje preostalih agregata ili malog - molekularnog onečišćenja težine. Također se može koristiti za određivanje molekulske mase pročišćene DNA polimeraze.
Konačna kontrola pročišćavanja i kvalitete
Nakon kromatografskih koraka, DNA polimeraza je obično visoko pročišćena. Međutim, još uvijek mogu biti prisutni neki manji zagađivači. Konačni korak poliranja, poput hidrofobne interakcijske kromatografije ili obrnute - fazne kromatografije, može se provesti za daljnje pročišćavanje enzima.
Jednom kada je pročišćavanje dovršeno, ključne su stroge mjere kontrole kvalitete. Čistoća DNA polimeraze može se procijeniti pomoću tehnika kao što je natrijev dodecil sulfat - poliakrilamidni gel elektroforeza (SDS - stranica). Jedan pojas na gelu ukazuje na uzorak visoke čistoće. Aktivnost DNA polimeraze može se mjeriti pomoću testa sinteze in vitro DNA. Specifična aktivnost, koja je količina enzimske aktivnosti po jedinici proteina, važan je parametar za procjenu kvalitete pročišćene DNA polimeraze.
Ostali srodni enzimi i naš portfelj proizvoda
Pored DNA polimeraze, naša tvrtka nudi i niz drugih kvalitetnih enzima za laboratorijska istraživanja. Na primjer, imamoGP41 protein 2.0, koji igra važnu ulogu u procesima replikacije DNK. Drugi proizvod jeExonuclease III 2.0, što je korisno za studije popravljanja i modifikacije DNK. I našSC RECA 2.0uključen je u homologne mehanizme rekombinacije i popravljanja DNK.
Zaključak
Pročišćavanje DNA polimeraze u laboratoriju je složen, ali nagrađivan proces. Pažljivim rastom stanica, lizom, kromatografskim pročišćavanjem i kontrolom kvalitete, u mogućnosti smo dobiti visoko čistu i aktivnu DNA polimerazu. Kao dobavljač DNA polimeraze posvećeni smo pružanju proizvoda s najviše kvalitete kako bi zadovoljili potrebe znanstvene zajednice. Ako vas zanima naša DNA polimeraza ili drugi enzimski proizvodi, pozivamo vas da nas kontaktirate radi nabave i daljnjih rasprava. Uvijek smo spremni ponuditi profesionalne savjete i podršku kako bismo osigurali da imate najbolje - odgovarajuće reagense za vaše istraživačke projekte.
Reference
- Sambrook, J., i Russell, DW (2001). Molekularno kloniranje: laboratorijski priručnik. Laboratorij za hladnu proljetnu luku.
- Scopes, RK (1994). Pročišćavanje proteina: principi i praksa. Springer - Verlag.
- Deutscher, MP (1990). Vodič za pročišćavanje proteina. Akademska tiska.