《Razvoj novog CAS13A/CAS12A posredovano"One-Pot" dvostruko Ispitivanje detekcije za genetski modificirane usjeve
Genetski modificirani usjevi široko su zasađeni širom svijeta, a mnoge su zemlje postupno poboljšale svoje regulatorne mjere kako bi osigurali sigurnost genetski modificiranih usjeva. Razvoj brzih i točnih metoda genetske detekcije na licu mjesta vrlo je važan za poljoprivredu i biološku sigurnost i može ublažiti zabrinutost javnosti zbog genetski modificiranih proizvoda.
U ovom istraživanju, istraživačka skupina razvila je novu reakciju s jednim loncom -- Mira Dual detekcija u kombinaciji s dvostrukim CRISPR-om (MR-DCA metoda) za istodobno otkrivanje CAMV35S i NOS genetskih ciljeva u genetski modificiranim kulturama, pružajući jednostavnu i učinkovitu metodu otkrivanja genetskih modificiranih kropsa.
Eksperimentalne metode
Dvostruki proizvod Mira analizira se dvostrukim sustavom Cas13a i Cas12a kako bi generirao dva neovisna signala koji se ne miješaju jedni s drugima, a zatim fluorescentnu boju čita instrument osvjetljenja ili testnom trakom s dvije T linije za postizanje dvokanalnog čitanja. Cijeli postupak je završen za manje od 35 minuta, s ograničenjem detekcije čak 20 primjeraka.
(Načelo otkrivanja MR-DCA CAMV35s i NOS)
Čitav eksperiment je podijeljen u tri koraka: pojačavanje MIRA, CRISPR reakcija i dvije metode interpretacije rezultata.
CAMV35S gen koristi se kao meta CAS13A, a NOS gen koristi se kao meta CAS12A. Dizajnirana su dva para Mira prajmera. CAS13A sustav prepoznaje samo RNA, tako da je dizajnirana regija prema naprijed, koja sadrži T7 promotor za naknadnu transkripciju i aktivaciju CAS13A. PAM se dodaje NOS genu. Gornji dodaci osiguravaju da se i CAS13A i CAS12A proteini mogu vezati za svoje CRRNA, a ne postoji smetnja ili unakrsna reakcija između dva sustava.
Eksperimentalna situacija
Osjetljivost i specifičnost
Uzorak je razrijeđen u gradijentu za ispitivanje intenziteta fluorescencije reakcije MIRA. Utvrđeno je da se intenzitet fluorescencije još uvijek može otkriti u koncentraciji uzorka od 20 μl. Koncentracija od 20 μL konačno je odabrana za eksperiment.
(Različite koncentracije uzorka i testne trake koriste se za izračun razvoja boje i kvantifikacije intenziteta)
Da bi se dodatno procijenila specifičnost MR-DCA, istraživački tim testirao je miješane uzorke netransgenih životinja i ne-transgenih biljaka. Rezultati su pokazali da samo transgeni uzorci koji sadrže CAMV35s i NOS imaju visoke fluorescentne signale, dok je intenzitet fluorescencije drugih uzoraka bio blizu onog negativne kontrole. MR-DCA se može koristiti kao specifična platforma za otkrivanje nukleinske kiseline s dvostrukim ciljevima.
MR-DCA je testirao 24 uzoraka usjeva. Među njima su 1, 2, 15, 16, 21 i 22 transgeni koji sadrže CAMV35S promotor. 7, 8, 23 i 24 su transgena riža otporna na bolest koja sadrži NOS terminator. 3, 4, 11, 12, 13, 14, 17 i 18 transgeni su soja koja sadrži promotor CAMV35S i NOS Terminator.
(Rezultati ispitivanja 24 uzoraka)
Brza reakcija
Vrijeme reakcije važan je faktor u otkrivanju na licu mjesta. Istraživački tim primijetio je da se fluorescentni signali FAM -a i heksa mogu otkriti fluorescentnim instrumentom kada je vrijeme reakcije bilo 10 minuta. MIRA u kombinaciji s CRISPR reakcijom također je primijetila žutu fluorescenciju nakon 15 minuta.
(Fluorescentni signal u različitim vremenima reakcije MIRA)
(Razvoj boje testnih traka u različitim vremenima reakcije MIRA i izračunavanje kvantifikacije intenziteta)
Eksperimentalni zaključak
Eksperimentalni rezultati pokazali su da dvostruka MIRA ima dobru specifičnost i može točno dobiti proizvode za pojačavanje CAMV35s i NOS. Sustavi CAS13A i CAS12A reagiraju neovisno bez ometanja jedni s drugima. MR-DCA test može točno otkriti 20 primjeraka na niskoj temperaturi od 35 minuta, što ima veliku vrijednost u otkrivanju genetski modificiranih usjeva na terenu.
Informacije o članku
Naziv časopisa: 《Časopis za napredne istraživanja Express
Naslov članka: 《Razvoj novog CAS13A/CAS12A-posredovanog testa dvostrukog otkrivanja "One-Pot" za genetski modificirane usjeve Express
Faktor utjecaja: 11.4
Istraživački tim: Wang Xiaofu, Zhejiang Akademija poljoprivrednih znanosti