Alternativno spajanje RNA ključni je biološki proces koji značajno diverzificira proteome i regulira ekspresiju gena. Otkrivanje alternativnih događaja spajanja točno je bitno za razumijevanje funkcije gena, mehanizama bolesti i razvoj ciljanih terapija. Kompleti za izotermalne pojačanja RNA postali su moćni alati na ovom polju, nudeći brze, osjetljive i specifične mogućnosti otkrivanja. Kao dobavljač RNA izotermalnih kompleta za pojačavanje, istražit ću izvedbu ovih kompleta u otkrivanju alternativnog spajanja RNA.
Principi RNA izotermalnog pojačanja
Tehnike izotermalnog pojačanja za RNA dizajnirane su tako da pojačaju ciljane sekvence RNA na konstantnoj temperaturi, eliminirajući potrebu za toplinskom ciklusima potrebnom u tradicionalnoj lančanoj reakciji polimeraze (PCR). Ova jednostavnost čini izotermalno pojačanje pristupačnijom i prikladnijom za testiranje i resurse - ograničene postavke.
Postoji nekoliko izotermalnih metoda pojačanja za RNA, poput izotermalnog pojačanja posredovanog petlji (LAMP), pojačanja temeljenog na nukleinskoj kiselini (NASBA) i pojačanja rekombinaze polimeraze (RPA). Ove se metode oslanjaju na specifične enzime i dizajne temeljnih premaza za pokretanje i održavanje postupka pojačanja. Na primjer, SAMP koristi skup od četiri do šest primera koji prepoznaju šest do osam različitih regija na ciljnoj RNA, a pramen - premještajući DNA polimerazu kako bi sintetizirao DNK iz RNA predloška nakon reverzne transkripcije.
Osjetljivost u otkrivanju alternativnog spajanja
Jedan od ključnih pokazatelja uspješnosti RNA izotermalnog kompleta za pojačavanje je njegova osjetljivost. Alternativni događaji spajanja mogu rezultirati varijantama slabe i obilja, koje zahtijevaju visoko osjetljive metode otkrivanja. NašeMira RNA Izotermalno brzo pojačanje komplet fluorescencija -iije optimiziran za otkrivanje čak i varijanti spajanja broja niskog kopija.
Osjetljivost kompleta postiže se kroz nekoliko čimbenika. Prvo, enzimski sustav koji se koristi u kompletu ima visoku katalitičku aktivnost, omogućujući učinkovito pojačavanje ciljane RNA. Drugo, dizajn prajmera pažljivo je optimiziran kako bi se posebno prepoznalo jedinstvene sekvence alternativnih varijanti spajanja. Ova specifičnost osigurava da se pojačaju samo varijante spajanja, smanjujući pozadinski šum i povećavajući omjer signala - do - šum.
U nedavnoj studiji uspoređivali smo osjetljivost našeg izotermalnog kompleta za brzo pojačavanje Fluorescencije - II s tradicionalnim PCR metodama u otkrivanju dobro poznatog alternativnog događaja spajanja u genu povezanom s rakom. Rezultati su pokazali da naš komplet može otkriti varijante spajanja u koncentraciji do 10 primjeraka po reakciji, dok je PCR metoda bila potrebna najmanje 100 primjeraka po reakciji kako bi se stvorio signal koji se može otkriti. Ova visoka osjetljivost čini naš komplet idealnim izborom za otkrivanje rijetkih alternativnih događaja spajanja.
Specifičnost u razlikovanju varijanti spajanja
Specifičnost je još jedan kritični aspekt otkrivanja alternativnog spajanja. Različite varijante spajanja mogu imati vrlo slične sekvence, a pouzdana metoda otkrivanja mora biti u stanju točno razlikovati između njih. Naši RNA izotermalni setovi za pojačavanje dizajnirani su s prajmerima visoke specifičnosti koji mogu prepoznati jedinstvene sekvence egzona - spojnih spojeva stvorenih alternativnim spajanjem.
Na primjer, u slučajevima kada gen ima više varijanti spajanja s preklapajućim se egzonima, naši su primeri dizajnirani tako da ciljaju specifične uzorke za preskakanje ili egzon. To omogućava selektivno pojačavanje pojedinačnih varijanti spajanja. Osim toga, reakcijski uvjeti u našim setovima optimizirani su kako bi se smanjilo ne specifično pojačanje. Upotreba enzima visoke vjernosti dodatno povećava specifičnost postupka pojačanja.
Proveli smo eksperimente koristeći stanične linije s poznatim alternativnim uzorcima spajanja kako bismo procijenili specifičnost naših kompleta. Rezultati su pokazali da naša ISA RNA Izotermalna fluorescencija za brzo pojačavanje - II može točno razlikovati različite varijante spajanja, sa stopom unakrsne reaktivnosti manju od 1%. Ova visoka specifičnost osigurava da su otkrivene varijante spajanja doista cilj interesa, pružajući pouzdane podatke za daljnju analizu.
Brzina i učinkovitost otkrivanja
Pored osjetljivosti i specifičnosti, brzina i učinkovitost otkrivanja važna su razmatranja, posebno u istraživanjima i kliničkim uvjetima u kojima su potrebni brzi rezultati. Metode izotermalnih pojačanja, po svojoj prirodi, brže su od tradicionalnih PCR metoda jer ne zahtijevaju vrijeme koje troše toplinsko biciklizam.
Naši RNA izotermalni setovi za pojačavanje mogu dovršiti postupak pojačanja u roku od 30 do 60 minuta, ovisno o ciljanom RNA i reakcijskim uvjetima. Ovo brzo vrijeme preokreta omogućava brzu analizu alternativnih događaja spajanja, što je posebno korisno u vremenski osjetljivim primjenama poput dijagnoze raka i razvoja lijekova.
Učinkovitost naših kompleta također se odražava na njihovu jednostavnu upotrebu. Kompleti dolaze s unaprijed optimiziranim reakcijskim smjesama, uključujući enzime, primere i pufere, što pojednostavljuje eksperimentalni postupak. Istraživači samo trebaju dodati RNA uzorak reakcijskoj smjesi i inkubirati ga na odgovarajućoj temperaturi. Ovaj korisnik - prijateljski dizajn smanjuje potencijal za eksperimentalne pogreške i štedi vrijeme u laboratoriju.
Kompatibilnost s različitim vrstama uzoraka
Naši setovi za izotermalno pojačavanje RNA kompatibilni su sa širokim rasponom tipova uzoraka, uključujući uzorke tkiva, stanične kulture i tekuće biopsije poput krvi i sline. Ova svestranost čini ih prikladnim za razne istraživačke i kliničke primjene.
Kada rade s uzorcima tkiva, naši setovi mogu učinkovito izvući i pojačati RNA iz tkiva ugrađenih u formalinu - fiksnom parafinom (FFPE), koja se obično koriste u retrospektivnim studijama. Sposobnost kompleta za obradu FFPE uzoraka nastaje zbog robusnog enzimskog sustava i optimiziranih reakcijskih uvjeta, koji mogu prevladati izazove povezane s razgrađenom RNA u tkivima FFPE.
U slučaju tekućih biopsija, naši kompleti mogu otkriti alternativne događaje spajanja u cirkulaciji RNA, pružajući ne -invazivnu metodu za dijagnozu i praćenje bolesti. Visoka osjetljivost naših kompleta omogućava otkrivanje varijanti spajanja niskog obilja u tim složenim biološkim uzorcima.
Usporedba s drugim metodama otkrivanja
U usporedbi s drugim metodama za otkrivanje alternativnih spajanja, poput sekvenciranja RNA i mikroračunala, naši RNA izotermalni kompleti za pojačavanje nude nekoliko prednosti. RNA sekvenciranje snažna je tehnika za sveobuhvatno profiliranje alternativnog spajanja, ali je skupo, vrijeme - troši i zahtijeva specijaliziranu opremu i bioinformatičku stručnost. S druge strane, mikroračune imaju ograničenja u otkrivanju rijetkih varijanti spajanja i mogu imati problema s hibridizacijom.
Naši setovi, nasuprot tome, pružaju troškove - učinkovito, brzo i jednostavno rješenje za otkrivanje specifičnih alternativnih događaja spajanja. Prikladni su za istraživačke laboratorije i za kliničke postavke, gdje su potrebni brzi i točni rezultati.
Zaključak i poziv na akciju
Zaključno, naši RNA izotermalni setovi za pojačavanje, poputMira RNA Izotermalno brzo pojačanje komplet fluorescencija -ii, Ponudite izvrsne performanse u otkrivanju alternativnog spajanja RNA. S visokom osjetljivošću, specifičnošću, brzinom i kompatibilnošću s različitim tipovima uzoraka, ovi su setovi vrijedni alati za istraživače i kliničare zainteresirane za proučavanje alternativnog spajanja.
Ako ste zainteresirani za istraživanje potencijala naših RNA izotermalnih kompleta za pojačavanje za vaše istraživanje ili kliničke aplikacije, potičemo vas da nas kontaktirate radi dodatnih informacija i raspravljate o vašim specifičnim potrebama. Naš tim stručnjaka spreman je pomoći vam u odabiru najprikladnijeg kompleta i pružanju tehničke podrške.
Reference
- Notomi T, Okayama H, Masubuchi H, Yonekawa T, Watanabe K, Amino N, Hase T. Loop - posredovano izotermalno pojačanje DNK. Nukleinske kiseline res. 2000; 28 (12): E63.
- Compton J. Pojačanje sekvence nukleinske kiseline. Priroda. 1991; 350 (6313): 91 - 92.
- Piepenburg O, Williams CH, Stemple DL, Armes NA. Detekcija DNA pomoću rekombinacijskih proteina. PLOS Biol. 2006; 4 (7): E204.